Kalau bekerja di laboratorium, khususnya bagian mikrobiologi, ada satu pemeriksaan yang cukup klasik tetapi sampai sekarang masih sangat dikenal:

pewarnaan BTA dengan metode Ziehl-Neelsen.

BTA adalah singkatan dari:

Basil Tahan Asam

Dalam bahasa Inggris disebut:

Acid-Fast Bacilli atau AFB.

Pewarnaan ini digunakan untuk membantu mendeteksi bakteri yang mempunyai sifat tahan terhadap proses pelunturan dengan asam, terutama kelompok Mycobacterium.

Metode yang paling terkenal adalah:

Ziehl-Neelsen atau ZN

Dan kalau melihat prosesnya, pewarnaan ini punya satu prinsip menarik:

bakterinya dicat merah…

lalu dicoba “dicuci” dengan asam.

Kalau tetap merah?

Nah, dia memang tahan banting. 😄

---

Apa Itu BTA?

BTA atau Basil Tahan Asam adalah bakteri berbentuk batang yang mampu mempertahankan warna tertentu meskipun sudah diberikan larutan asam atau asam-alkohol saat proses dekolorisasi.

Sifat tersebut terutama berkaitan dengan struktur dinding sel mycobacteria yang kaya lipid dan asam mikolat.

Lapisan lipid yang tebal membuat pewarna biasa lebih sulit masuk.

Tetapi setelah pewarna seperti carbol fuchsin berhasil masuk ke dalam sel, warna tersebut menjadi sulit dihilangkan oleh larutan asam. WHO menjelaskan bahwa mycobacteria memiliki lapisan berlilin yang memungkinkan mereka mempertahankan pewarna anilin setelah proses dekolorisasi dengan asam dan alkohol. Iris

Inilah asal istilah:

acid-fast

atau:

tahan asam.

---

Apakah BTA Positif Berarti Pasti Mycobacterium tuberculosis?

Tidak selalu.

Ini sangat penting.

Jika ditemukan BTA pada sediaan sputum, hasil tersebut dapat mendukung kecurigaan penyakit TB, tetapi tidak selalu membuktikan bahwa bakteri tersebut pasti Mycobacterium tuberculosis.

CDC menegaskan bahwa hasil smear AFB positif tidak secara otomatis mengonfirmasi TB, karena mycobacteria non-tuberkulosis atau NTM juga dapat menunjukkan sifat acid-fast. Sebaliknya, smear negatif juga tidak menyingkirkan TB, karena jumlah basil dapat terlalu sedikit untuk terlihat di mikroskop. CDC

Jadi:

BTA positif ≠ otomatis MTB pasti.

Dan:

BTA negatif ≠ otomatis bukan TB.

Pemeriksaan BTA adalah salah satu bagian dari proses diagnosis.

---

Prinsip Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Pada pewarnaan ZN, prinsip dasarnya menggunakan tiga tahap utama:

1. Pewarnaan utama
2. Dekolorisasi
3. Counterstain

Reagen yang digunakan secara umum adalah:

• Carbol fuchsin
• Acid-alcohol atau larutan asam
• Methylene blue

WHO menjelaskan bahwa pada metode Ziehl-Neelsen, apusan diberi carbol fuchsin dan dipanaskan, kemudian dilakukan dekolorisasi menggunakan asam/alkohol, lalu diberikan pewarna tandingan methylene blue. BTA akan tetap berwarna merah karena tahan terhadap proses dekolorisasi. Iris

Secara sederhana:

Carbol fuchsin → masuk ke BTA

↓

Asam mencoba melunturkan

↓

BTA tetap merah

↓

Background diberi methylene blue

Hasil akhirnya:

BTA merah dengan latar belakang biru.

---

Reagen 1: Carbol Fuchsin

Carbol fuchsin merupakan pewarna utama dalam metode ZN.

Warnanya merah kuat.

Karena dinding sel mycobacteria sangat kaya lipid, pewarna sulit masuk hanya dengan pewarnaan biasa.

Karena itu metode ZN klasik menggunakan pemanasan untuk membantu penetrasi carbol fuchsin ke dalam dinding sel. WHO menyebut hot Ziehl-Neelsen sebagai salah satu metode pewarnaan efektif untuk basil tuberkulosis. Iris

Setelah pewarna berhasil masuk…

mycobacteria menjadi cukup posesif.

Warnanya tidak mau dilepas lagi. 😆

---

Reagen 2: Acid-Alcohol atau Larutan Dekolorisasi

Tahap berikutnya adalah:

dekolorisasi.

Tujuannya adalah menghilangkan carbol fuchsin dari struktur yang tidak tahan asam.

Pada metode tertentu digunakan:

acid-alcohol

sedangkan pedoman lain dapat menggunakan larutan asam seperti sulfuric acid pada konsentrasi tertentu. Karena itu komposisi reagen harus mengikuti kit, SOP, atau protokol laboratorium yang digunakan. WHO mendokumentasikan variasi penggunaan acid-alcohol maupun asam pada metode ZN. Iris

Setelah dekolorisasi:

• Struktur non-acid-fast kehilangan warna merah
• BTA tetap mempertahankan warna carbol fuchsin

Di sinilah sebenarnya sifat:

“tahan asam”

terlihat.

---

Reagen 3: Methylene Blue

Setelah proses dekolorisasi, diberikan pewarna tandingan atau:

counterstain

yang biasanya menggunakan:

methylene blue.

Tujuannya adalah memberikan warna pada material latar belakang agar BTA terlihat lebih kontras.

Hasil akhirnya:

BTA

Merah / merah muda

Background

Biru

WHO menggambarkan basil pada pewarnaan ZN sebagai batang halus berwarna merah yang tampak jelas terhadap latar biru. Iris

Jadi kalau di mikroskop kita melihat:

batang merah tipis di antara latar biru

itulah morfologi yang dicari.

---

Sampel Apa yang Biasanya Digunakan?

Untuk pemeriksaan TB paru, sampel yang sangat umum adalah:

sputum.

Bukan saliva.

Ini penting.

Sputum yang baik berasal dari saluran napas bawah setelah batuk dalam.

Sampel yang hanya berisi air liur dapat mempunyai kualitas diagnostik yang lebih rendah karena tidak mewakili sekret dari saluran napas bawah.

Dalam praktik laboratorium, bagian sputum yang lebih purulen atau mukoid biasanya dipilih untuk pembuatan apusan karena dianggap lebih representatif.

---

Membuat Sediaan BTA

Secara umum, tahap awalnya meliputi:

1. Gunakan kaca objek bersih
2. Beri identitas sesuai prosedur
3. Ambil bagian sputum yang representatif
4. Buat apusan dengan ketebalan yang sesuai
5. Biarkan mengering
6. Lakukan fiksasi sesuai metode

WHO menekankan pentingnya apusan yang tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis. Dalam salah satu pedoman mikrobiologi WHO, apusan yang baik dibuat merata dan cukup tipis sehingga tulisan di bawah kaca masih dapat terbaca. Iris

Kalau apusan terlalu tebal:

• Pewarnaan bisa tidak merata
• Dekolorisasi menjadi sulit
• Lapang pandang terlalu penuh debris
• BTA lebih sulit dikenali

Kalau terlalu tipis:

• Jumlah material terlalu sedikit
• Kemungkinan menemukan basil berkurang

Jadi idealnya:

tidak seperti tembok semen, tapi juga bukan cuma bekas napas di kaca. 😄

---

Tahapan Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Detail waktu dan konsentrasi reagen dapat berbeda antar-kit dan SOP, tetapi prinsip klasiknya adalah sebagai berikut.

1. Apusan Difiksasi

Setelah apusan benar-benar kering, dilakukan fiksasi sesuai prosedur.

Tujuannya antara lain membantu material menempel pada kaca objek selama proses pewarnaan.

---

2. Tambahkan Carbol Fuchsin

Seluruh area apusan ditutup dengan carbol fuchsin.

Pada metode ZN klasik, slide kemudian dipanaskan perlahan hingga muncul uap. Lalu didiamkan selama 5 menit

Tujuannya membantu pewarna menembus lapisan lipid mycobacteria. Iris

Penting:

dipanaskan bukan berarti dibakar.

Kita ingin melihat uap.

Bukan membuat:

sputum bakar. 😆

Pemanasan berlebihan dapat merusak preparat dan menimbulkan risiko keselamatan.

---

3. Bilas

Setelah proses pewarnaan utama selesai, slide dibilas sesuai prosedur untuk menghilangkan kelebihan carbol fuchsin.

---

4. Dekolorisasi

Kemudian diberikan:

acid-alcohol atau reagen dekolorisasi sesuai kit.

Tahap ini menghilangkan warna merah dari material yang tidak tahan asam.

BTA tetap mempertahankan carbol fuchsin.

Proses dekolorisasi sangat penting.

Kalau terlalu sedikit:

background masih merah dan bisa menimbulkan kesulitan interpretasi.

Kalau terlalu berlebihan atau prosedurnya tidak tepat:

kualitas pewarnaan juga dapat terganggu.

---

5. Bilas Kembali

Setelah dekolorisasi selesai, slide dibilas kembali.

Pada tahap ini, area apusan biasanya sudah jauh lebih pucat kecuali struktur acid-fast yang mempertahankan warna merah.

---

6. Counterstain dengan Methylene Blue

Selanjutnya preparat ditutup dengan:

methylene blue.

Methylene blue akan memberikan warna biru pada background.

Setelah waktu pewarnaan sesuai prosedur tercapai (20 detik), slide kembali dibilas. Iris

---

7. Keringkan

Preparat dibiarkan:

air dry.

Jangan menggosok area apusan.

Setelah benar-benar kering, preparat siap dibaca menggunakan mikroskop.

---

Membaca Sediaan BTA

Sediaan Ziehl-Neelsen diperiksa menggunakan:

objektif 100× oil immersion.

Dengan okuler 10×:

pembesaran total = 1000×.

WHO menganjurkan pembacaan menggunakan objektif oil immersion 100× untuk sediaan ZN. Iris

Pada sediaan positif, BTA umumnya tampak sebagai:

• Batang tipis
• Merah atau merah muda
• Bisa sedikit melengkung
• Kadang tampak granular atau seperti manik-manik
• Dapat terlihat sendiri, berpasangan, atau berkelompok

dengan background:

biru. Iris

---

Seperti Apa Bentuk BTA?

WHO menggambarkan basil tuberkulosis pada ZN sebagai batang halus berwarna merah, sedikit melengkung, kadang granular, dan dapat ditemukan tunggal maupun berkelompok. Iris

Namun dalam pembacaan mikroskopis, kita harus hati-hati terhadap artefak.

Tidak semua benda merah berbentuk panjang adalah BTA.

Misalnya:

• Endapan pewarna
• Serat
• Goresan pada slide
• Debris
• Kontaminan

dapat membuat pemeriksa yang belum berpengalaman berpikir:

“Nah ketemu!”

Padahal setelah fokus digeser…

ternyata hanya noda cat yang mempunyai ambisi menjadi mycobacteria. 😆

Karena itu pengalaman membaca morfologi sangat penting.

---

Cara Pelaporan BTA

Hasil BTA tidak hanya dilaporkan:

positif atau negatif.

Jumlah basil juga dapat dinyatakan secara semi-kuantitatif.

WHO menggunakan skala pembacaan ZN seperti berikut: Iris

Hasil Pengamatan	Pelaporan
Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang	Tidak ditemukan BTA
1–9 BTA dalam 100 lapang pandang	Laporkan jumlah BTA yang ditemukan
10–99 BTA dalam 100 lapang pandang	1+
1–10 BTA per lapang pandang	2+
>10 BTA per lapang pandang	3+

Untuk kategori yang lebih tinggi, jumlah lapang pandang yang perlu diperiksa dapat lebih sedikit sesuai sistem grading yang digunakan. WHO mencantumkan pembacaan 100 lapang untuk hasil rendah, sekitar 50 lapang untuk 2+, dan sekitar 20 lapang untuk 3+. WHO | Regional Office for Africa

Tetapi sistem pelaporan harus tetap mengikuti:

pedoman nasional dan SOP laboratorium masing-masing.

---

Apa Arti 1+, 2+, dan 3+?

Secara sederhana, grading tersebut menunjukkan:

kepadatan BTA yang terlihat pada sediaan.

1+

BTA ditemukan dalam jumlah relatif sedikit.

2+

Jumlah BTA lebih banyak.

3+

BTA ditemukan dalam jumlah sangat banyak.

Semakin tinggi grading, semakin tinggi jumlah basil yang terlihat dalam apusan.

Namun grading smear tidak boleh digunakan sendirian untuk menilai seluruh kondisi pasien.

---

Bagaimana Kalau Hanya Ditemukan 1–9 BTA?

Kalau BTA ditemukan sangat sedikit, hasil biasanya dilaporkan sebagai:

jumlah aktual BTA per 100 lapang pandang

bukan langsung diberi grading 1+. Iris

Contoh:

3 BTA / 100 lapang pandang

Kondisi seperti ini membutuhkan ketelitian ekstra karena semakin sedikit basil yang ditemukan, semakin besar kebutuhan memastikan bahwa yang terlihat benar-benar BTA dan bukan artefak.

---

Apa Artinya Kalau BTA Tidak Ditemukan?

Kalau setelah jumlah lapang pandang yang dipersyaratkan tidak ditemukan BTA, hasil dilaporkan sebagai:

BTA tidak ditemukan

atau format sesuai SOP.

Namun:

Negatif BTA bukan berarti TB pasti tidak ada.

CDC menegaskan bahwa pasien tetap dapat menderita TB meskipun smear AFB negatif karena jumlah basil dapat berada di bawah batas deteksi mikroskop. CDC

Karena itu pemeriksaan TB modern juga dapat melibatkan metode lain seperti:

• Tes molekuler
• Kultur
• Pemeriksaan klinis
• Radiologi
• Pemeriksaan lainnya

sesuai indikasi.

---

Mengapa Pemeriksaan Molekuler Tetap Penting?

Salah satu keterbatasan terbesar mikroskop BTA adalah:

kita melihat bentuk acid-fast bacilli, tetapi tidak mengetahui identitas spesiesnya hanya dari ZN.

Tes molekuler seperti NAAT dapat membantu mendeteksi materi genetik Mycobacterium tuberculosis complex dan pada sistem tertentu sekaligus memberikan informasi mengenai resistensi obat tertentu.

Jadi Ziehl-Neelsen masih berguna…

tetapi dia bukan:

detektif lengkap dengan DNA database.

Dia lebih seperti:

“Saya melihat ada tersangka berbentuk BTA.”

Pemeriksaan lain yang membantu memastikan siapa tersangkanya. 😄

---

Faktor yang Bisa Menyebabkan Hasil Negatif Palsu

Pemeriksaan BTA cukup bergantung pada kualitas proses.

Beberapa masalah yang dapat menurunkan peluang menemukan basil antara lain:

• Sampel kurang representatif
• Hanya saliva
• Jumlah BTA sedikit
• Apusan terlalu tipis
• Area yang diperiksa tidak memadai
• Pewarnaan kurang baik
• Dekolorisasi tidak sesuai
• Pembacaan mikroskop kurang teliti

Karena itu kualitas pemeriksaan sebenarnya dimulai sejak:

pengambilan sputum.

Bukan baru saat slide sudah berada di depan mikroskop.

---

Faktor yang Bisa Menyebabkan Hasil Positif Palsu

Sebaliknya, hasil juga bisa keliru ke arah positif.

Contohnya akibat:

• Kontaminasi silang
• Endapan pewarna
• Slide yang tidak bersih
• Kesalahan identifikasi artefak
• Kesalahan pelabelan
• Kontaminasi reagen tertentu

Karena itu kontrol mutu pada pemeriksaan BTA sangat penting.

WHO bahkan menyediakan SOP khusus untuk rechecking smear BTA sebagai bagian dari quality assurance laboratorium TB. WHO Extranet

---

Kenapa Carbol Fuchsin Bisa Membentuk Endapan?

Carbol fuchsin dapat mengalami presipitasi atau membentuk endapan jika kondisi penyimpanan dan filtrasi reagen tidak baik.

Endapan merah dapat menyerupai struktur yang membingungkan.

Karena itu pada beberapa protokol, carbol fuchsin perlu difiltrasi sesuai ketentuan sebelum digunakan.

WHO dalam panduan laboratorium mencatat pentingnya menyiapkan dan menjaga kualitas larutan carbol fuchsin dengan benar. Iris

Jadi kalau seluruh slide penuh titik merah acak…

jangan langsung bergembira:

“Wah 3+ semua!”

Bisa jadi reagent-nya yang sedang membuat karya seni abstrak. 😆

---

Keselamatan Kerja Sangat Penting

Sputum dari pasien yang diduga TB merupakan bahan yang berpotensi mengandung mikroorganisme infeksius.

Karena itu pemeriksaan harus dilakukan sesuai prinsip biosafety laboratorium.

Hal yang perlu diperhatikan antara lain:

• APD sesuai risiko
• Pengelolaan sputum yang aman
• Pencegahan aerosol
• Penanganan limbah
• Dekontaminasi
• Ventilasi atau fasilitas sesuai standar
• Teknik kerja yang benar

Selain itu beberapa reagen pewarnaan juga mempunyai risiko kimia.

Phenol pada carbol fuchsin dan larutan asam harus ditangani dengan hati-hati.

Jadi pada pemeriksaan BTA kita menghadapi:

risiko biologis + risiko kimia.

Laboratorium memang senang paket lengkap. 😅

---

Ziehl-Neelsen dan Auramine, Apa Bedanya?

Selain ZN, pemeriksaan BTA juga dapat menggunakan:

pewarnaan fluorokrom, misalnya auramine.

Pada ZN:

BTA terlihat merah dengan background biru dan dibaca menggunakan mikroskop cahaya, biasanya objektif 100× oil immersion.

Pada auramine:

BTA akan memberikan fluoresensi terang pada background gelap dan dapat diperiksa menggunakan pembesaran yang lebih rendah pada mikroskop fluorescence. WHO menyebut salah satu keuntungan auramine adalah area sediaan dapat dipindai lebih cepat dibandingkan ZN.

Jadi kalau jumlah slide sangat banyak, fluorescence microscopy dapat memberikan keuntungan dalam kecepatan pembacaan.

Namun alat dan prosedurnya tentu berbeda.

---

Ringkasan Reagen Ziehl-Neelsen

Reagen	Fungsi
Carbol fuchsin	Pewarna utama BTA
Acid-alcohol / asam	Menghilangkan pewarna dari organisme non-acid-fast
Methylene blue	Pewarna tandingan/background

---

Ringkasan Hasil Pewarnaan

Struktur	Warna
BTA	Merah / merah muda
Background	Biru

---

Ringkasan Proses ZN

Secara sederhana:

Buat apusan

↓

Keringkan dan fiksasi

↓

Carbol fuchsin

↓

Pemanasan sesuai metode

↓

Bilas

↓

Dekolorisasi

↓

Bilas

↓

Methylene blue

↓

Bilas dan keringkan

↓

Baca dengan objektif 100× oil immersion

---

Kesalahan Kecil Bisa Mengubah Hasil

Pewarnaan BTA terlihat seperti proses yang cukup sederhana.

Tetapi kualitas hasil dipengaruhi hampir di setiap tahap:

sampel → apusan → fiksasi → pewarnaan → dekolorisasi → counterstain → pembacaan

Kalau sampelnya buruk, hasil bisa buruk.

Kalau apusannya terlalu tebal, pembacaan bisa sulit.

Kalau pewarna tidak baik, visualisasi terganggu.

Kalau dekolorisasi tidak benar, background membingungkan.

Kalau mikroskop atau pembacaan tidak optimal, basil dapat terlewat.

Jadi ketika hasil BTA keluar…

sebenarnya ada cukup banyak proses yang sudah dilalui oleh satu slide kecil tersebut.

---

Kesimpulan

Pewarnaan Ziehl-Neelsen merupakan metode klasik untuk mendeteksi Basil Tahan Asam atau BTA pada sediaan mikroskopis.

Prinsipnya memanfaatkan kemampuan mycobacteria mempertahankan carbol fuchsin meskipun sudah dilakukan dekolorisasi dengan larutan asam atau acid-alcohol. Setelah diberikan methylene blue sebagai counterstain, BTA terlihat merah dengan latar belakang biru. Iris

Pemeriksaan dilakukan menggunakan mikroskop dengan:

objektif 100× oil immersion. WHO | Regional Office for Africa

Hasil dapat dilaporkan sebagai:

• Tidak ditemukan BTA
• Jumlah BTA aktual bila sangat sedikit
• 1+
• 2+
• 3+

sesuai jumlah basil yang ditemukan. WHO | Regional Office for Africa

Namun satu hal yang penting:

hasil BTA positif tidak selalu berarti pasti Mycobacterium tuberculosis, dan BTA negatif tidak menyingkirkan TB. CDC

Karena itu pemeriksaan ZN harus dipahami sebagai salah satu bagian dari pemeriksaan tuberkulosis, bukan satu-satunya penentu diagnosis.

Dan mungkin hal paling menarik dari pewarnaan ini adalah:

kita memulai dengan sputum yang secara visual mungkin tidak terlihat istimewa…

beberapa langkah kemudian…

kita bisa melihat batang merah yang ukurannya hanya beberapa mikrometer.

Mikroskop memang membuat dunia laboratorium terasa sedikit seperti berburu sesuatu yang tidak ingin ditemukan. 😄

---

Sumber Referensi

Artikel ini menggunakan sumber utama dari World Health Organization (WHO) mengenai prinsip, reagen, metode Ziehl-Neelsen, pembacaan mikroskop dan grading BTA. Iris

Informasi mengenai keterbatasan smear AFB serta fakta bahwa BTA positif tidak selalu mengonfirmasi Mycobacterium tuberculosis mengacu pada Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDC

Catatan: Konsentrasi reagen, waktu pewarnaan, jenis dekolorisator, metode fiksasi, jumlah lapang pandang, dan format pelaporan harus mengikuti SOP laboratorium, petunjuk reagen/kit, serta pedoman nasional yang berlaku. Artikel ini ditujukan sebagai materi edukasi dan bukan pengganti SOP teknis laboratorium.